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转染sf9细胞制备重组杆状病毒
发布日期:2022-04-29     浏览次数:19
核心提示:1.3重组杆状病毒的制备 根据JEV GX株的基因组序列设计RT-PCR引物,同时为了提高外源蛋白的表达并分泌到上清中,在设计引物时加入了蜂素信号肽(HBM)
 

1.3重组杆状病毒的制备  根据JEV GX株的基因组序列设计RT-PCR引物,同时为了提高外源蛋白的表达并分泌到上清中,在设计引物时加入了蜂素信号肽(HBM)以及靠近NS1序列5′端的24个E基因的氨基酸序列(24E),引物由武汉生工生物公司合成,引物序列见表1。上下游引物分别引入EcoR I和Xho I酶切位点(表中上游斜体为信号肽序列,下游斜体为His标签序列):

用表1中的引物对NS1基因进行RT-PCR扩增,扩增产物和pFastBac载体使用EcoR I和Xho I酶进行双酶切,酶切后使用T4DNA连接酶连接并转化到DH5α感受态细胞中,提取重组质粒,测序后和模板比对正确。将重组质粒转化到DH10α感受态细胞中,通过蓝白斑筛选出转座成功的重组杆粒,之后按照Invitrogen的杆状病毒操作手册,转染sf9细胞制备重组杆状病毒,根据插入的目的基因不同,将重组杆状病毒命名为rBacmid-JEV-HBM-NS1和rBacmid-JEV-24E-NS1。

1.4重组NS1蛋白的表达验证

1.4.1Western Blot验证  分别收取感染重组杆状病毒后的sf9细胞和培养基上清,加入Loading Buffer处理后,进行SDS-PAGE电泳,利用电转膜仪将样品转到PVDF膜上,结束后使用1% BSA室温封闭2 h,1:4000加入His抗体孵育2 h,PBST洗涤三遍后1:5000加入羊抗鼠IgG二抗孵育40 min,洗涤三遍后显色。

 
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